质粒目的基因插入及引物设计流程

质粒目的基因插入及引物设计流程
预览:

一.寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框(蛋白质对应的基因序列)

1.选中CDS开发阅读框(表达蛋白的序列)基因序列,共162个碱基; 2. 注意CDS特征,前段非编码区如果太长,需要增加保护序列;后端非编码区如果长, 则说明CDS序列稳定可用;

将查到的CDS序列粘贴至new DNA file框中,选择linear类型DNA,软件即可自动分析该 段序列中的可能酶切位点

二. 登录http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V652020?ICID=search-product 找到质粒的全序列

同样将该质粒序列粘贴至软件中,比较目的基因和质粒的多克隆位点(即酶切位点)

1.质粒选择酶切位点的原则:目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点, 否则目的基因会被切掉;
2. 质粒上选择酶切位点应该尽可能短,为将来其他可能的克隆预留位置,如本实验质粒 选择Aflll和BamH1,目的基因上均不存在酶切位点,实验室也买了,可用:

选中目的基因序列,复制

在AflI后至BamHI 前的序列插入目的基因序列,并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1

在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HA tag标签(阳性对照蛋白,即质粒转染并成 功表达的话,该段蛋白必定存在,可用WB测出),标签序列登录addgene官网查询:
https://www.addgene.org/mol-bio-reference/genetic-code/

三.克隆引物设计 1. 电脑设计:回到NCBI的primer blast,拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基), 在框中输入>|a|和CDS序列,并在Min 和Max分别输入1602(表示blast CDS全部基因);

2.手工设计: 遵循GC尽量少,Tm尽量小的原则,5端后选20个左右;3端从酶切位点终点往前数59个, 因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。

5端引物序列即为atggctgtggagtcccag, 但是还要再加上一段保护碱基AAATATATCTTAAG 最后可得Forward primer为AAATATATCTTAAGatggctgtg

tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct 目的基因的20个碱基
3端引物设计的起点(不含BamHI酶切位点)和方向

最后要把引物顺序调整过来,点击“5→3”既得Reverse primer序列tcaAGCGTAATCTGGAAC ,同样在5端位置需再加上一段保护碱基AAATATATGGATCC 最后Reverse primer序列为AAATATATGGATCC tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtctt

构建表达载体的一般流程:
设计primer(如上所述,综合考虑HA,CDS序列)→合 成引物→选择合适的样本细胞 (本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶, 因此最好选择肝脏细胞系),提取
mRNA并逆转录成cDNA→用设计的primer扩增目的基 因(UGT1A1)→琼脂糖凝胶电泳→ 切胶回收特异条带→目的基因与质粒酶切结合,转 染细菌扩大培养→提取质粒,测序判断质粒是否成 功构建→建立稳定转染的细胞系→筛选

第1页/共26页 下一页>尾页